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关键字:粘度计、金属浴、均质机、超声波细胞破碎仪、组织研磨仪

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破碎细胞遇到的常见问题

文章出处:原创 作者:Lawson(洛尚中国) 人气: 192 发表时间:2018/6/18 10:52:06

1. 大肠杆菌表达外源蛋白,在超声破碎的时候,用含有1%triton-X-100的PBS悬浮,然后超声的效果较好,1%triton-X-100的作用还是很明显的,对其他的一些细菌同样起作用,比如链霉菌。在表达重组蛋白后用超声波细胞破碎仪破碎细胞,采用冰浴,400w,破碎2s停1s,但是不一会就产生大量泡沫,影响了破碎功率,pbs和tris缓冲液都是这样,zui后都是破碎不完全,而目的蛋白就在这些未破碎的细胞中,怎么办?

解析:会产生气泡是因为探头位置没放好;探头一定要接近底部,约0.5-1cm;功率根据仪器不同会有所不同,但可以观察液面,有波动但不要太剧烈;可以选择超声波细胞破碎仪破碎3s停10s,破碎20-30次;变幅杆位置摆放也要注意,听声音如果不对的话就要及时调整;从菌浓度方面考虑。在破碎时试着加大体积,强度zui好不要超过60%;尝试破碎8s停8s,对有些菌体蛋白来说,难散热导致蛋白变性产生气泡,可以停顿时间稍长一些,这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

2. 链霉菌(放线菌)超声破碎条件是什么?

解析:放线菌属于原核生物系统进化树上的(G+C)摩尔百分含量(mol%)高的革兰氏阳性菌(Eubacteria)分枝类群,它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性,但在其不同类群中,细胞壁的化学组分变化很大。在做大肠杆菌超声时,采用的是400W,破碎5s停5s的方法,效果不错,但是用在链霉菌上,由于细胞壁组成差异一般没什么效果。 链霉菌(放线菌)超声破碎前处理一般是配置成一定浓度的菌悬液。使用超声波细胞破碎仪破碎时采用的具体条件是:取细菌的24 h培养液于5 000 r/min 下离心5 min收集菌体;用pH 7.5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次,再用该缓冲液将菌体配成1:3的菌悬液。置于40 mL大塑料试管内;将大塑料试管置于冰浴中,采用超声波细胞破碎仪破碎(功率200W,1/2”探头,破碎30s,间歇30s);破碎液于12 000 r/min下高速冷冻离心30 min,收集细胞碎片和上清夜。洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris-HCl,洗涤一次就可以。另外,超声剂量随样品量、菌体改变比较大,功率可以到400-600w,破碎5s,停5s,冰浴,要加终浓度1 mM的PMSF。为确定合适的超声强度和次数,有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。


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